Bir sonraki adım, CRISPR kompleksinin bunlarla nasıl etkileşime girdiğini, AlphaFold yapay zeka tabanlı protein katlama yazılımını kullanarak incelemekti. Güncellenmiş sürümler, proteinler ve nükleik asitler arasındaki etkileşimlerin yanı sıra birden fazla proteinden oluşan kompleksleri de işleyecek şekilde tasarlandı. Ekip, AlphaFold'a hedef DNA dizisinin bir versiyonunu, bir kılavuz RNA'yı, Cas9 dizisini ve kimyasal olarak bazları değiştiren ve Cas9'a yapışabilen bir enzimi besledi.
Ne yazık ki, yazılım takıldı ve proteinlerden birini açıkça yanlış bir konuma yerleştirdi.
Yılmadan, ekip işleri basitleştirdi ve AlphaFold'a yalnızca DNA, RNA ve Cas9 proteinini besledi, çünkü ikincisi dizi özgüllüğünü belirleyen ana faktör. Bu çok daha iyi çalıştı ve gerçek nükleik asitler ve proteinlerle yapılan deneylerle belirlenen yapılarla uyumlu bir yapı üretti.
Araştırmacılar, AlphaFold'un farklı hedef ve hedef dışı bölgelerle beslendiğinde oluşturduğu yapıları karşılaştırarak genel bir örüntü buldu. Hedef dışı bölgelerin yaklaşık üçte ikisi, Cas9 proteininin biraz farklı bir yapı benimsemesine neden oldu. Ancak neredeyse tamamı (yüzde 95'inden fazlası), RNA'ya temas eden amino asitleri değiştirdi. Yani, Cas9'un normal yapısını koruduğu ancak içindeki amino asitlerin, hedef dışı bölgelerin yanlış eşleşmiş bazlarını barındıracak şekilde esnediği durumlar da var.
Uygun bir şekilde, AlphaFold zaten 'temas olasılığı' olarak adlandırılan şeyi, yani amino asitler veya nükleotitler gibi herhangi iki öğenin çok küçük bir mesafe (sekiz Angstrom) içinde olma olasılığını belirlemek için ayarlanmıştı. Araştırmacılar, hedef ve hedef dışı bölgeler için temas olasılığı analizinin çıktısını alıp karşılaştırarak, kılavuz RNA ile DNA arasında bir uyumsuzluk olduğunda Cas9'daki hangi amino asitlerin değişmiş temaslara sahip olduğunu tam olarak belirleyebildi. Bu bilgisayarlı analiz düzeneğine 'ContactSeek' adını verdiler.
Daha İyi Hedefleme
Tek başına ContactSeek, hedef dışı bir bölgeye bağlandığında yer değiştiren çok sayıda amino asit listesi üretme eğilimindeydi. Bu nedenle araştırmacılar, bu amino asitlerin kümelenmiş olduğu Cas9 protein bölgelerine odaklandı ve bunu, bu alanların yanlış eşleşmiş bazların neden olduğu farklılıklara uyum sağladığının bir işareti olarak değerlendirdi. Ardından, bu bölgelerde farklı amino asitler bulunan Cas9 versiyonlarını test etmeye başladılar.
